荧光定量PCR试剂盒说明书和操作步骤

支原体荧光定量PCR法是一种基于荧光定量PCR技术的检测方法，专门用于支原体的检测。这种方法在常规PCR的基础上，将针对支原体特异性保守序列的探针进行荧光标记，使得PCR扩增后的产物带有荧光。利用荧光信号的变化和配套软件，可以实时监测DNA扩增反应，即实时荧光定量PCR（qPCR）。

荧光定量pcr试剂盒说明书和使用方法

德国MB公司生产的荧光定量PCR试剂盒（均为探针法检测），依据操作步骤的细微差别， 分『经典法』和『一步法』两种。   

此两类试剂盒较全球其他厂家同类产品，具有以下独特的优点：

①经典法荧光定量PCR试剂盒遵循欧洲药典流程要求

②高特异性，一次检测即可涵盖了所有可能感染细胞的支原体物种（涵盖欧洲药典规定的9种支原体），根据序列一致性，至少可以检测到107种支原体物种。操作简单，易于观察（使用MB的试剂盒，下表中列出的支原体物种均为阳性，其他微生物或真核细胞均为阴性，无交叉反应）。

③高灵敏度，MB公司的支原体荧光定量PCR试剂盒经典法最低检测限可达到≤10CFU/ml。

MB公司的支原体qPCR检测试剂盒一步法最低检测限≥50个基因组/反应。

④MB公司有相应配套的10CFU/100CFU的敏感度测试的标准品，便于方法学验证。

⑤MB公司有相应配套的支原体基因组DNA和细菌基因组DNA，便于特异性验证。

⑥MB公司有相应配套的支原体绝对定量标准品，便于最后定量检测。

荧光定量PCR试剂盒特点

1.内控对照为独立包装，遵循欧洲药典和日本药典操作流程。

2.高特异性，一次检测即可涵盖所有常见易感染细胞的支原体物种（包括欧洲药典规定的9种支原体）。与细菌和真核DNA无交叉反应。

3.高灵敏度，最低检测限可达到≤10CFU/ml。

4.相应配套的支原体基因组DNA和细菌基因组DNA，便于特异性验证。

5.有相应配套的支原体绝对定量标准品，便于最后定量检测。

荧光定量PCR试剂盒操作步骤

第1步：样本处理

a.细胞培养上清

b. 生物药或需遵循药典的样本

说明：①样品基质可能会影响检测的灵敏度。收集和筛选更高的样品量可提高测定灵敏度。

    ②细胞培养物样本含丰富的DNA酶，在低温下也能降解支原DNA，影响检测灵敏度。

建议：样本做DNA抽提处理，实现最高灵敏度。

推荐：德国MB公司生产的专用支原体DNA提取试剂盒

Venor® Gem Sample Preparation Kit

该DNA抽提试剂盒已经过广泛验证。

第2步：试剂制备

a.冻干粉溶解

b. 反应体系制备

b1) 样品为细胞上清筛查——反应体系制备

b2) 样品为生物药——反应体系制备

第3步：启动荧光定量PCR仪

第4步：结果判别

FAM通道：检测支原体荧光信号。HEX通道：检测内控对照荧光信号。

支原体DNA和内控DNA存在信号的竞争性抑制。

支原体DNA越多，FAM通道信号越高，检测内控对照的HEX通道信号越低。

定量需基于Ct值和DNA标准曲线。

Ct＜40为阳性结果。Ct≥40为阴性结果。

示意图：

主要用途

荧光定量PCR试剂盒主要用于基因组DNA靶序列和RNA反转录后cDNA靶序列的检测。

保存与使用

保存条件：试剂盒通常需要在低温下保存，2~8℃保存至少12个月。复溶后-18℃以下保存。

注意事项

请务必遵照产品说明书的储存条件和使用方法，否则无法保证试剂盒的性能和保质期。

试剂盒在使用过程中，应避免污染和交叉污染，以确保实验结果的准确性。