原代小胶质细胞培养方法

原代小胶质细胞培养是一个涉及多个步骤的复杂过程，以下是对其培养方法的详细阐述：

一、原理

原代小胶质细胞培养主要利用混合胶质细胞培养物分层生长的特性，以及小胶质细胞半悬浮生长的特点，通过摇床震荡法将皮层来源的混合胶质细胞培养物最上层的小胶质细胞震摇下来继续培养，以达到分离和纯化小胶质细胞的目的。

二、材料与仪器

材料：新生1-3天的仔鼠、含10%胎牛血清的DMEM培养基、D-PBS液、消化液（0.25%胰蛋白酶+0.04%的EDTA）等。

仪器：37℃恒温摇床、离心机、显微镜、培养瓶、培养皿、细胞滤网等。

三、步骤

准备阶段：按照培养少突胶质细胞的方法，待10天后细胞分层生长。此时显微镜下可见满视野圆形、折光性强的小胶质细胞，附着在贴壁生长、紧密连接在一起的星形胶质细胞层上面。

振摇阶段：将培养瓶固定到37℃恒温摇床上，以80-200转/分钟的速度振摇2小时左右。

收集与种植：收集振摇下来的小胶质细胞，种植到多聚赖氨酸包被的培养皿中，加入新的含10%胎牛血清的DMEM培养基继续培养。

换液与传代：每2-3天更换一次培养基。如果根据实验需要传代培养，可以采用细胞刮子刮下细胞接种到新的培养皿中，或用0.25%胰酶+0.04%的EDTA消化后进行传代。

四、质量控制

可以通过流式细胞术分析样品的纯度、细胞活力甚至绝对计数，以确保所得小胶质细胞的质量。

五、注意事项

所有步骤要无菌操作，以避免小胶质细胞被污染或被微生物及毒素激活。

在振摇细胞之前，一定要确保底层的星形胶质细胞铺满培养瓶，并紧密连在一起，否则振摇过程中会将星形胶质细胞层摇起。

六、常见问题

振摇分离出小胶质细胞后，将新的培养液加入原培养瓶中继续培养，数天后又会出现大量的小胶质细胞，如此可以重复甚至更多次振摇收集小胶质细胞。

由于小胶质细胞数目所占比例较小，在体外较难分裂增殖，故其产量不高。有文献报道可以采用营养缺失法或加入单核细胞集落刺激因子（M-CSF）以增加产量。

综上所述，原代小胶质细胞培养是一个需要精细操作的过程，通过合理的培养条件和步骤设置，可以获得高质量的小胶质细胞，为后续的科研实验提供有力支持。