原代培养之组织块培养法＋消化培养法操作步骤及注意事项

原代培养也叫初代培养，是从供体取得组织细胞后在体外进行的**培养。原代培养方法有很多，常用的有组织块法和消化法。

组织块培养法

操作步骤：

处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2-3次，去除血污。

剪切：用眼科剪把组织切成2mm3左右的块。

铺瓶：将剪切好的组织小块，用眼科镊或吸管送入培养瓶内，每小块间距约5mm，均匀铺在瓶底。

轻轻翻转培养瓶，使瓶底朝上，然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞，将瓶倾斜放置在37℃温箱内；2~4h待组织小块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养；
约24h后补液，3~5d可换液，7-9d便开始有细胞从组织块周围爬出。

注意事项:

1.剪切组织时可滴加1~2滴含血清培养液，可减少组织快漂浮。

2.如怀疑组织污染，可先置于含有青链霉素

的混合液中浸润30min。

3.瓶壁均匀摆置，25m工培养瓶约接种20~30

小块为宜。

4.观察和移动过程中注意要动作轻巧，尽量不要引起液体的振荡而产生对组织块的冲击力使其漂起:

5.若组织块不易贴壁可预先在瓶底壁涂薄层血清或鼠尾胶原等以增加组织块黏附力。

6.原代培养的1~2d内要特别注意观察是否有细菌、霉菌等的污染。

7.对原代培养要及时观察，发现细胞游出后要记录。

8.原代培养3~5d换液，瓶中漂浮的组织块和残留的血细胞或细胞生长较多时，全部更换新鲜培养液，细胞较少时，可换半培养液已漂浮的组织块和细胞碎片，含有有害物质，会影响原代细胞的活力和生长，应及时清除。

消化培养法

操作步骤：

处理组织：用Hanks液漂洗组织2~3次，去除血污；

剪切：用眼科剪把组织切成2mm3左右的块。加入比组织块总量多3-5倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入培养皿中。

消化：置于37℃温箱消化，每隔20分钟摇动一次。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。

分离：在消化过程中见消化液混浊时，吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500~1000rpm）离心5min，收集细胞，弃上清。

加入适量培养基重悬细胞，装入培养瓶中，补足培养基。

培养：计数后，置于37℃,5%CO2培养箱培养。

注意事项:

1.如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30min。

2.根据组织类型选择适宜的消化酶，尤其是注意选择适当类型的胶原酶。

3.控制消化时间，避免消化过度，造成细胞膜损伤，从而影响细胞贴壁及生长。

4.**进行原代培养时，适当提高接种细胞密度，有助于提高培养成活率。