细胞培养支原体污染,细胞成团怎么办

当细胞培养中出现支原体污染，并且细胞成团时，需要采取一系列措施来处理这一问题。以下是一些建议的步骤：

一、确认污染并评估情况

确认污染：通过显微镜观察、PCR检测或其他支原体检测方法确认细胞确实已被支原体污染。

评估细胞价值：判断被污染的细胞是否珍贵、样品是否可再得，以及是否值得进行挽救处理。

二、处理污染细胞

1. 丢弃并重新复苏

适用情况：对于易于重新获得的细胞株，或者污染严重的细胞，建议直接处理培养物，丢弃所有被污染的细胞和耗材。

操作步骤：

终止试验，丢弃所有被污染的细胞和耗材。

重新复苏细胞，注意选用未被污染的细胞株、血清和培养基，并规范操作。

2. 挽救处理

适用情况：对于珍贵的、样品不可再得的细胞，或价格昂贵的种子细胞，需要进行挽救处理。

操作步骤：

洗涤细胞：使用D-PBSA（稀释的磷酸盐缓冲液）洗涤细胞，以减少污染物数量。对于单层细胞，用D-PBSA浸洗培养物3次，胰蛋白酶消化，通过离心重悬用D-PBSA再洗细胞2次；对于悬浮细胞，用D-PBSA离心重悬洗涤细胞。

高种植密度接种：以高种植密度接种1个或多个新培养瓶，以减少支原体污染的机会。

使用抗生素：加入高浓度抗生素培养基，每2天换液。如果不同类型的抗生素与BM-Cyclin交替使用，细胞应在应用新抗生素前换液。注意，过度使用抗生素可能产生更强抗性的菌株，撤药后极易复发，因此需谨慎使用。

长期无抗生素培养：去掉抗生素后，在无抗生素培养细胞的状况下培养细胞至少2周，然后再次进行支原体检测。如果检测结果仍为阴性，可继续在无抗生素的条件下培养细胞至少2个月，以确保所有污染已被移除。

三、预防未来污染

严格操作规范：加强实验室的清洁和消毒工作，严格遵守无菌操作规范。工作开始时要先用75%酒精消毒手部以及袖口、瓶口等；在进行多种细胞培养操作时，所用器具（如移液枪等）要严格区分；在进行换液或传代操作时，注射器和滴管不要触及细胞培养瓶瓶口，以免把细菌带到培养液中污染其他细胞。

保证培养基和器材无菌：确保细胞培养基和器材的无菌性。器材一般都经过辐射处理，基本可以保证无菌；商业化CD培养基一般也能保证无菌。如实验室有发现支原体感染，已经开启的培养基不宜继续使用。

定期检测：定期对实验室中的培养物进行支原体检测，以及时发现和处理污染问题。

四、其他注意事项

在处理支原体污染时，应使用孔径为0.1微米或更小孔的膜的过滤培养基和缓冲液，因为孔径为0.22或0.45微米的标准培养基过滤装置无法除去这些小的微生物。

如果支原体污染严重且难以清除，可以考虑使用特异性的支原体杀除剂或抑制剂进行处理。但请注意，这些试剂可能价格较高且使用效果因细胞类型和污染程度而异。

综上所述，处理细胞培养中的支原体污染需要根据具体情况采取合适的措施，并加强预防措施以避免未来再次发生污染。