干货分享：支原体检测方法学验证的通关秘籍

近年来，生物医药领域取得了飞速进步，细胞治疗等项目已成为该领域的焦点。与此同时，为确保生物制品的安全性和可靠性，各国法规及相关监管机构正不断强化对其的监督力度。其中，一个关键的问题就是“如何对生物制品进行检测，以确保产品的生物安全”。对于涉及细胞培养的生物制品生产工艺，各国法规均明确规定了相应的检测标准与要求。

欧洲药典（EP）和日本药典（JP）中规定的生物制品支原体检测的方法主要包括以下几种：培养法、染色法（指示细胞法）、核酸扩增技术（NAT）。由于方法自身的局限性，越来越多的生产企业选择用NAT法替代培养法和染色法。但在药典中明确指出，NAT法需要经过方法学验证，与传统方法（培养法和染色法）进行对比，对比项目包括特异性、检测灵敏度等指标，要求NAT法结果不低于传统方法，才可以使用。

不同药典在特异性（Specificity）、检测限（Detection Limit）和耐用性（Robustness）三方面进行了要求。

特异性：特异性指在其他成分（如杂质、降解产物、辅料等）可能存在下，采用的检测和分析方法能正确测定出待检物种的能力。

检测限：检测限是指样品中被测物能被检测出的最低量。对需要进行检测限确认的支原体类型，试剂盒厂家需尽可能多的覆盖法规药典中要求的支原体类型。

耐用性：耐用性是指，检测条件有小的变动时，检测结果不受影响的承受程度。比如，抑制物质实验可检测实验的耐用性。

药典中规定如果NAT法用于替代传统的培养法，其检测限需达到10CFU/ml（菌落形成单位/毫升）。这意味着，NAT法能够检测到每毫升样品中至少10个支原体菌落。如果NAT法用于替代DNA染色法，其检测限则需达到100CFU/ml。

为了确保NAT法的灵敏度达到这一标准，需要使用支原体灵敏度标准品进行验证。这些标准品通常是冻干粉型的灭活支原体，涵盖了药典规定的所有支原体物种。通过将这些标准品与待测样品一起进行检测，可以验证NAT法的最低检测限。

在实验过程中，虽然可以通过在实验室自行灭活购自菌种保藏中心（如ATCC或NCTC）支原体菌株的方法，制备得到支原体标准品，但通过该方法得到的灭活菌株标准品，批次间差异可能比较大，很难实现真正意义上的“标准化”，且每次制备都要进行对标准品稳定性检测，耗时耗力效果差，很难保障方法学验证的顺利推进。

因此，大多数生物药、细胞治疗等产业的生产厂家，都会选择商品化的支原体检测标准品，批量化的高效生产，每批次的严格质检，专业的冻干技术，能够帮助相关工业生产企业顺利完成方法学验证。

以常用的德国Minerva Biolabs的10CFU支原体检测限标准品为例，这类符合药典的商品化标准品，都具备以下特点：

符合欧洲药典（EP）和日本药典（JP）方法学验证要求。

所有菌株都在低传代中培养，支原体在对数生长期收获，经测定，确保GU与CFU的比率符合要求，可溯源至ATCC、NCTC同序列号的菌株。

全面覆盖：涵盖了欧洲药典和日本药典规定的所有支原体物种（见下表），用于支原体核酸扩增法（PCR/qPCR）的方法学验证。商品化标准品通常涵盖了欧洲药典和日本药典规定的所有支原体物种，用于支原体核酸扩增法（PCR/qPCR）的方法学验证（检测限和耐用性验证），无需实验室自行筛选和制备。

即用型产品：商品化标准品经过严格的制备和质量控制，可以直接用于方法学验证，无需额外的处理或优化步骤，提高了验证的效率和便捷性。

提供详细文档：商品化标准品通常附有详细的分析证书（COA），提供该批次GU:CFU比值（支原体基因组/菌落数比值）等信息，有助于实验室更好地了解和使用标准品。

采用冻干科技，冻干粉形式使产品更稳定、储存成本更低、运输更便捷。

产品线齐全，从支原体提取试剂盒、支原体qPCR检测试剂盒、支原体基因组DNA、经灭活PCR绝对定量标准品需全覆盖，一站式解决支原体方法学验证问题。

商品化的10CFU支原体检测标准品在质量稳定性与可靠性、验证效率与便捷性、安全性与合规性等方面表现出明显的优势，更有利于实验室进行方法学验证。