细胞冻存和复苏的原理和过程

细胞冻存与复苏是一种用于长期储存细胞的技术，其原理和过程分别如下：

细胞冻存的原理

细胞冻存是指将细胞保存在超低温环境中，暂时停止细胞的代谢活动，使细胞进入“冬眠”状态的一项技术。一般细胞冻存遵循“慢冻”原则，这是因为在降温过程中，细胞器会脱水，细胞内可溶性物质浓度增加，并形成冰晶。缓慢冷冻的过程可以逐渐使细胞脱水，以防止细胞内形成大冰晶，因为大冰晶可能导致细胞膜和细胞器的损伤和破裂。同时，常使用二甲基亚砜（DMSO）或甘油作为细胞冷冻保护剂，其应用原理在于：一方面可以提高细胞膜对水的通透性，使细胞内水分渗出到细胞外，在一定程度上可以减少胞内冰晶的产生；另一方面可以使冰点降低，延缓整个冷冻过程。

细胞冻存的过程

细胞冻存的一般过程如下：

准备细胞：选择对数生长期的细胞进行冻存，确保细胞状态良好且无污染。同时，根据细胞类型控制好细胞的密度。

配制冻存液：根据实验习惯配制冻存液，一般包含培养基、血清和DMSO等成分。配制完成后，需严格避光保存。

分装细胞：将细胞悬液与冻存液混合均匀后，分装入冻存管中，每管1~1.5ml。同时，在冻存管上标明细胞的名称、冻存时间及操作者等信息。

降温冻存：标准的冻存程序为降温速率-1-2℃/min；当温度达到-25℃以下时，可增至-5℃-10℃/min；直到-100℃时，可迅速浸入液氮中。此外，也可以采取手动梯度降温法或程序降温盒法进行冻存。但需要注意的是，手动梯度降温不易把控，温度不稳定，可能降低细胞存活率，因此不太建议使用。

细胞复苏的原理

细胞复苏是指将冻存在液氮或超低温冰箱中的细胞解冻之后重新培养，使细胞恢复生长的过程。其原理在于当细胞恢复到常温状态时，其形态结构保持正常，生化反应即刻恢复。细胞复苏过程升温要快，原则是“慢冻快融”，以防止在解冻过程中水分进入细胞，形成冰晶，影响细胞存活。

细胞复苏的过程

细胞复苏的一般过程如下：

取出冻存管：从液氮容器中或超低温冰箱中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动，促使其尽快融化。需要注意的是，应避免水浴时间过长或温度过高，以减少DMSO对细胞的毒性作用。

处理细胞悬液：从37℃水浴中取出冻存管后，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加入离心管中，并滴加10倍以上的培养液，混匀。

离心弃上清：对细胞悬液进行离心处理，弃去上清液。

重悬细胞：加入含10%小牛血清的培养液以重悬细胞。进行计数后，调整细胞密度，然后将其接种到培养瓶中。

静置培养：将接种后的培养瓶置于37℃培养箱中静置培养。次日更换一次培养液后继续进行培养。

注意事项

在细胞冻存和复苏过程中，需要注意以下事项：

确保细胞状态良好：在冻存之前，确保细胞具有良好的形态且无污染。

选择适合的冻存液：根据细胞类型选择合适的冻存液，并按照相应的操作规程进行细胞的冻存和复苏。

控制细胞密度：冻存时要控制好细胞的密度，避免过低或过高影响冻存效果。复苏后也需要根据细胞类型和生长情况进行适当的调整。

合理存放：细胞长期存放在-80℃冰箱时，建议靠冰箱内侧放置样本，避免开关冰箱导致温度不稳定影响细胞保存效果。

检测存活率：细胞冻存后应取出一管进行复苏，并检测细胞的存活率。为稳妥起见，可在细胞冻存半年后进行复苏培养并观察细胞生长情况。

综上所述，细胞冻存与复苏的原理和过程都至关重要，正确的操作方法和注意事项可以确保细胞的存活率和生长状态。