干货分享：荧光定量PCR原理和操作步骤

荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR）是一种在PCR扩增反应体系中加入荧光基团，对扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。以下是荧光定量PCR的原理和步骤的详细解释：

一、荧光定量PCR原理

荧光定量PCR的基本原理是利用DNA聚合酶在PCR过程中合成新DNA链的特性，结合一种荧光标记的探针或染料，通过实时监测荧光信号的增加来测量PCR反应的进行程度，从而实现对靶DNA的定量分析。

在PCR扩增时，加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针（如TaqMan荧光探针），该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。开始时，探针完整地结合在DNA任意一条单链上，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，检测不到荧光信号。PCR扩增时，Taq酶（具有5'-3'外切酶活性）将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

另外，荧光定量PCR所使用的荧光物质也可分为荧光染料（如SYBR荧光染料）和荧光探针两类。在PCR反应体系中加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR仅与双链DNA进行结合，因此可以通过溶解曲线确定PCR反应是否特异。

二、荧光定量PCR步骤

荧光定量PCR的实验步骤通常包括反转录（如检测RNA样品时）、扩增和检测三个主要阶段。以下是具体步骤：

反转录（如适用）：对于RNA样品，首先需要使用反转录酶将RNA反转录成cDNA，以便后续进行PCR扩增。

扩增：在PCR反应管中加入适量的cDNA模板、引物、dNTPs（脱氧核糖核苷三磷酸）、缓冲液和Taq DNA聚合酶等反应成分。然后，在PCR仪上进行扩增反应。扩增过程通常包括变性、退火和延伸三个步骤，通过控制温度和时间来实现DNA的扩增。

检测：在PCR扩增过程中，实时检测荧光信号的强度。随着产物的积累，荧光信号的强度等比加强。每经过一次循环，收集一次荧光信号，即可得到一个荧光扩增曲线。根据荧光强度的变化即可监测产物量的变化，从而实现对靶DNA的定量分析。

需要注意的是，荧光定量PCR的实验步骤可能因实验目的和所用试剂的不同而有所差异。因此，在具体实验时，应参考试剂说明书和实验指南进行操作。

综上所述，荧光定量PCR是一种高灵敏度、高特异性的定量分析方法，在生物医学研究、疾病诊断、病原体检测等领域具有广泛的应用价值。