PCR扩增过程主要三个步骤

PCR扩增过程

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发表时间:2025-01-13 17:11

PCR扩增Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应)是一种在体外扩增特定DNA片段的技术。其基本过程包括三个主要步骤:变性、退火和延伸,这三个步骤在一个循环中重复多次,从而实现DNA的指数级扩增。

变性

温度:通常将反应体系加热至 94-98°C

目的:高温使双链 DNA 的氢键断裂,两条链解开成为单链,以便引物能够与模板链结合。

时间:一般持续 15-30 秒,以确保所有的双链 DNA 都完全解链。

退火

温度:温度降低至 50-65°C

目的:引物与单链 DNA 模板的互补序列特异性结合,形成 DNA 模板 - 引物复合物,为后续的 DNA 合成提供起始位点。退火温度的设定取决于引物的序列和长度等因素,一般根据引物的 Tm 值进行优化选择1

时间:持续 15-30 秒,让引物有足够的时间与模板 DNA 结合。

延伸

温度:提升至 72°C 左右。

目的:在热稳定 DNA 聚合酶(如 Taq 聚合酶)的作用下,以 dNTP 为原料,按照碱基互补配对原则,从引物的 3’端开始,沿模板链合成新的 DNA 链。

时间:根据目标 DNA 片段的长度而定,通常每 1kb DNA 需要 1 分钟左右。

这三个阶段构成了一个 PCR 循环,一个典型的 PCR 实验可能包含 25-40 个这样的循环,以获得足够量的目标 DNA。在完成设定的循环次数后,一般还会设置一个最后的延伸步骤,如在 72°C 下延伸 5-10 分钟,以确保所有 DNA 片段都被完全合成。

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