支原体检测pcr法有验证方案吗 二维码
发表时间:2025-01-14 16:46 确认所采用的支原体 PCR 检测方法在检测限、特异性、准确性、精密度和耐用性等方面符合预期要求,能够准确、可靠地检测样本中的支原体。 验证范围 适用于使用 PCR 法对各类样本(如细胞培养物、生物制品、临床样本等)中的支原体进行检测。 验证内容及方法 检测限验证 标准品制备:获取或制备已知浓度的支原体标准菌株,如猪鼻支原体、口腔支原体、肺炎支原体等,将其进行系列稀释,得到不同浓度的标准品溶液,浓度范围应涵盖预期的检测限及以下搜狐网。 PCR 检测:使用待验证的 PCR 方法对各浓度标准品进行检测,每个浓度至少进行 3 次重复实验。 结果判断:以能够稳定检测出阳性结果的最低标准品浓度作为该方法的检测限。欧洲药典规定,支原体核酸扩增检测方法如替代培养法,对常见 9 种支原体的检测限需均达到 10CFU/ml。 特异性验证 选择对照菌株:除了支原体标准菌株外,还应选择与支原体具有较近亲缘关系的细菌,如梭菌、乳酸杆菌和链球菌等,以及可能存在于样本中的其他微生物作为对照。 PCR 检测:分别以支原体标准菌株、对照菌株和阴性对照(无模板)进行 PCR 扩增。 结果判断:只有支原体标准菌株出现特异性扩增条带或荧光信号,而对照菌株和阴性对照无扩增,表明该方法具有良好的特异性。 准确性验证 样本选择:选取已知感染支原体的阳性样本和未感染支原体的阴性样本,阳性样本可以是经其他可靠方法确认的临床样本、细胞培养物等,阴性样本应确保无支原体污染。 PCR 检测:使用待验证的 PCR 方法对阳性和阴性样本进行检测。 结果判断:与已知结果进行对比,阳性样本检测结果应为阳性,阴性样本检测结果应为阴性,计算准确率。准确率 =(真阳性 + 真阴性)/(总样本数)×100%,准确率应达到较高水平,一般要求在 95% 以上。 精密度验证 重复性实验:选取高、中、低不同浓度的支原体标准品或阳性样本,在同一实验条件下,由同一操作人员使用同一台 PCR 仪,在短时间内进行多次重复检测,一般重复次数不少于 10 次。 中间精密度实验:不同操作人员在不同时间、使用不同的 PCR 仪和试剂批次对上述样本进行检测。 结果判断:计算重复性和中间精密度实验的标准差和变异系数,变异系数应在可接受范围内,一般要求小于 15%。 耐用性验证 改变反应条件:分别对 PCR 反应的退火温度、引物浓度、模板量、循环次数等关键参数进行适当的改变,如在标准反应条件的基础上,将退火温度上下浮动 5℃,引物浓度增加或减少 1 倍等。 PCR 检测:使用改变条件后的反应体系对支原体标准品和阳性样本进行检测。 结果判断:观察检测结果的变化情况,若在一定范围内改变反应条件后,仍能准确检测出支原体,且检测限、特异性、准确性等指标无明显变化,则表明该方法具有较好的耐用性。 验证结果记录与报告 详细记录每次实验的条件、样本信息、检测结果等数据。 对验证结果进行统计分析和总结,撰写验证报告,包括验证目的、方法、结果、结论以及建议等内容。如果验证结果符合要求,则该 PCR 方法可用于常规支原体检测;如果不符合要求,则需要对方法进行优化和改进,重新进行验证。 下一篇细胞污染了能修复回来吗
文章分类:
支原体检测盒及标准品
|
|