支原体常规检测方法汇总（四）

       大家晚上好！       

       不知不觉细胞培养过程中支原体检测内容已经更新到第四期了，回顾一下知识点。

       被广泛使用的方法

       基于Venor®Gem qEP经典法试剂盒的qPCR检测法，目前使用较为广泛，拥有高特异性、高灵敏度等特点，还可以选配支原体和细菌DNA、支原体绝对定量标准品，来进行特异性验证、定量检测。   

       经典法pro版   

       基于Venor®Gem qOneStep一步法试剂盒的qPCR检测法，是经典法的升级版本，包含经典法所有优点。另外，内控已配置好，更加省时省力。   

       传统认为的金标准   

       分离培养法被认为是支原体检测的金标准，准确率比较高，但培养周期长，而且对于一些特定支原体无法培养。   

       操作步骤多但简单   

       DNA染色法检测支原体虽然操作步骤较多，包含指示细胞培养，上清液共培养、染色等多个过程，但并不复杂，对技术要求相对没有那么高。       

       今天我们就来介绍最后两种常见检测法    ELISA法和PCR法，废话不多说，我们直接上干货。           

       ELISA法       

       首先我们先来简单了解一下ELISA：       

       酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，简写ELISA或ELASA）指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。根据免疫吸附剂、酶联物、结合物这些试剂的来源、样本情况，检测具体条件，可以分为夹心法、竞争法、间接法等不同类型。

       支原体检测过程中用到的ELISA，一般采用的是夹心法，针对支原体16S rRNA基因的带标记探针或抗体，来检测培养物中是否含有支原体。

       先用纯化过的支原体抗体包被微孔板，制成固相抗体。    ⬇   

       往微孔板中依次加入支原体（Mycoplasmal），再与 HRP（一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物）标记的支原体抗体结合，形成抗体 -抗原-酶标抗体复合物。    ⬇   

       经过彻底洗涤后加底物 TMB显色。TMB在 HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成黄色。       

       最后用酶标仪分析结果：       

       颜色的深浅和样品中的支原体（ Mycoplasmal）呈正相关。用酶标仪在 450nm波长下测定吸光度（ OD值），通过标准曲线计算样品中支原体浓度。整个过程时间比较短，一般三四个小时就能出结果。       

       整个过程除取样外，还包括标准品稀释、加样、温育、配液、洗涤、加酶、温育、洗涤、显色、终止、结果分析，步骤比较多，且很多步骤都需要有一定经验的人操作才能保证准确性，因此对技术要求比较高。

       另外，由于依赖抗体的特性，该方法能够检测的支原体种类比较有限，对于没有抗体的支原体，ELISA就无能为力了。       

       PCR法       

       常规PCR法：根据支原体核糖体16s-23s rRNA的特异保守序列设计引物，对待检样本DNA进行扩增，通过对扩增产物的大小分析作出判断。以Venor®Gem OneStep支原体常规PCR检测试剂盒为例，简单介绍一下实验流程。

       样本处理

       与qPCR类似取适量待检测样品上清95℃孵育10min以对样品进行稳定化处理   ⬇       

       试剂制备   

       离心➡按比例混合➡静置➡混匀   ⬇           

       PCR体系建立   

       设置好阴性对照、阳性对照、重复孔扣紧盖子混匀   ⬇           

       启动PCR反应   

       根据使用说明设置好程序   ⬇           

       电泳结果分析           

       191bp为内控对照条带，表明PCR反应正常。       

       当样本存在支原体污染时，由于内控对照与支原体DNA存在竞争，内控对照条带变弱（例如支原体DNA＞1000拷贝）。阳性对照中支原体DNA＞10000拷贝，内控对照条带会完全消失。可能在80-90bp存在引物自退火形成的条带，此条带不影响检测结果。如果待测样本对PCR产生抑制，则内控对照条带变弱（和阴性对照相比），此时应先进行DNA抽提（推荐使用：Venor® Gem Sample Preparation Kit 支原体DNA抽提试剂盒），然后再检测。           

       常规PCR的优点就是检测时间短：2-3小时即可出结果、灵敏度高、特异性强、操作简单。 缺点也很明显，用PCR检测已经进行过支原体灭活的样品时，由于支原体DNA依然存在，所以此时PCR结果仍为阳性，说明该样品曾经感染过支原体。另外不同厂家的试剂盒差异比较大，需要谨慎选择。       

       ELISA法       

       至此，几种常规的检测方法都已经介绍给大家啦，给大家做了个小总结，供参考。有些单一的检测方法并不严谨，需要结合实验情况，联合使用多种方法进行检验，确保结果的可信度。          培养法是金标准，但是周期长，有些支原体还检测不到；染色法普适性强，操作简单，但是对于支原体数量有要求，也容易有假阳性假阴性；ELISA法耗时短，但是对操作人员要求比较高，需要获得相应抗体才可以进行试验；常规PCR法，基本包含了上面所有的优点，但是不能分辨支原体的死活，用到的试剂盒也是良莠不齐； qPCR法，涵盖上述所有优点，但是对实验人员有一定的经验要求，因此该方法目前也是十分常用的检测手段。