支原体常规检测方法汇总（三）

       大家晚上好！       

       细胞培养过程中支原体检测方法如约而至    第三期来啦！

       上回书和上上回书说道qPCR检测法是一种目前比较常用，效果也比较可靠的方法，那除了qPCR，还有没有其他方法可以检测呢？

        所以今天就来讲讲分离培养法和DNA染色法。

        有请两位主角闪亮登场

        1.分离培养法       

        简单来说，这种方法的基本原理就是：分离，然后培养，听君一席话如听一席话，展开来讲，就是从可疑的细胞培养体系中取样，接种到适宜支原体生长的琼脂平板上。如果样本中含有支原体，它们就会在这种琼脂平板上疯狂生长，最终形成明显可见的特征性菌落。操作规范的情况下，这种方法很少会出现假阴性结果，检测精确度很高，因此被誉为支原体检测金标准。        缺点就是检测时间太长，支原体要长出明显克隆至少需要4周时间。另一方面，尽管可以检测绝大多数支原体种类，分离培养法也有力所不及的时候，例如支原体M. Hyorhinis。因此，该方法能鉴定的支原体种类有限，成为它的另一个缺点。       

        2.DNA染色法       

        该方法的实验思路是：

        培养指示细胞    ⬇   

        样品上清液收集    ⬇     

        上清液接种    ⬇   

        染色观察结果       

        这一波操作看起来有点复杂，那展开说说：将供试品接种于指示细胞（无污染的Vero 细胞或经国家药品检定机构认可的其他细胞，供试品应对该细胞生长无影响。下面以Vero细胞为例）中培养后，用特异荧光染料（如Hoechst 33258）染色，支原体中的核酸也可以被着色，因此，如果待检测细胞中含有支原体，那么就会导致指示细胞被感染，进而在细胞膜或培养基等处发现蓝色荧光（支原体附着在细胞膜上，也有可能游离在细胞培养基中）。

        指示细胞培养：将指示细胞复苏、传代，调整至**状态，留出适宜的量备用。   

        样品上清液收集：无抗生素培养基中加入待检测样品后，细胞需至少传一代，然后取细胞已长满且3 天未换液的细胞培养上清液待检。（为了对待检测样品中的支原体进行富集）   

       上清液接种：在制备好的指示细胞培养板中加入一定量的待检细胞培养上清，36°C培养3-5 天。指示细胞培养物至少传代1 次，末次传代培养可用6孔板培养3-5 天。   

       染色观察：吸出培养孔中的培养液，加入固定液，放置5分钟。吸出固定液后进行10min的二次固定，再次吸出固定液，使盖玻片在空气中干燥。加DNA 染料工作液5ml，加盖，室温放置30分钟，漂洗3次，干燥，封片。用荧光显微镜观察。荧光显微镜下可见细胞表面或培养基中，有大小不等、不规则的蓝色荧光着色颗粒，则说明有可能存在支原体污染。

        对于DNA染色法方法，优缺点也是很明显的：       

        优点：       

        1、适用于一些不易培养的支原体，如猪鼻支原体，分离培养法对该支原体检测并不可靠，但可用DNA染色法准确地检测出来。           

        2、操作步骤虽然多，但都相对简单           

        3、灵敏度尚可。       

         缺点：       

        1、时间较长，从Vero细胞复苏、传代，再到收集上清后再次培养，有时甚至需要十几天时间       

        2、存在假阳性和假阴性的可能：如一些死亡细胞释放出来的DNA会被染成蓝色，出现假阳性；或是由于荧光过若而出现假阴性使结果出现偏差，因此使用这个方法需要一定的经验。          今天的两种方法就介绍到这里啦，如果对支原体检测感兴趣，也可以点击文末的阅读原文，了解更多详情！